အခုပြောမဲ့ အကြောင်းအရင်းကတော့ Cloning လုပ်ထားပီး တစ်ညကျော်အကြာမှာ colony ထွက်မလာတဲ့ ကိစ္စပါ... Cloning မအောင်မြင်ရတဲ့ အကြောင်းအရင်းကအများကြီးရှိပါတယ်။ Vector ကို enzyme cutting လုပ်ရာမှာ အလုံးစုံ ပြည့်ပြည့်ဝဝ cutting/digestion မဖြစ်သွားတာ၊ Ligation က မအောင်မြင်တာ၊ ပီးတော့ antibiotics မှားသုံးမိတာ အစရှိတဲ့ အကြောင်းအရာတွေကြောင့် ဖြစ်နိုင်ပါတယ်။
အဲ့ထဲမှာမှ Vector ကို enzyme cutting/digestion လုပ်တဲ့နေရာမှာ မှားတတ်တဲ့ အကြောင်းအရာလေးကို ပြောပြပေးသွားမှာပဲ ဖြစ်ပါတယ်။
Vector ဆိုတာ cloning လုပ်တဲ့ အခါမှာ သုံးတဲ့ DNA အပိုင်းအစလေးတစ်ခုဖြစ်ပီးတော့မှ သူဟာဆိုလို့ရှိရင် ပြင်ပက DNA အစိတ်အပိုင်းကို သူရဲ့ DNA ထဲကို ထည့်သွင်းထားလို့ ရပီးတော့မှ အေးအေးဆေးဆေးနဲ့ သက်ရှိထဲမှာ ပြင်ပက ၀င်လာတဲ့ DNA အစိတ်အပိုင်းကို ထိန်းသိမ်းထားနိုင်တဲ့ အတွက် Vector ကို Cloning လုပ်တဲ့ ရည်ရွယ်နဲ့ အသုံးပြုကြတာပဲ ဖြစ်တယ်။ အဲ့ Cloning လုပ်တဲ့ Vector ရဲ့ DNA ကို ဘယ်ကနေမှ ရလာသလဲဆိုရင် ဗိုင်းရပ်စ်၊ အဆင်မြင့်တဲ့ သက်ရှိ တစ်ကောင်ကောင် ဒါမှမဟုတ်ရင် ဘတ်တီးရီးယားရဲ့ plasmid (သေးငယ်ပီးတော့ အ၀ိုင်း ပုံစံရှိတဲ့ ဘတ်တီးရီးယားရဲ့ DNA) ကနေပီးတော့မှ ရရှိတာဖြစ်တယ်။
Cloning လုပ်တော့မယ်ဆိုရင် အဓိက လိုအပ်တာ ၂ ခုရှိတယ်.. လက်ခံကောင် DNA (Vector) နဲ့ ကိုယ့်ထည့်သွင်းလို့တဲ့ကောင် DNA (Insert) တို့ပဲဖြစ်တယ်။ ကိုယ့်ထည့်သွင်းလိုတဲ့ DNA ကို လက်ခံမဲ့ Vector ကို ထည့်သွင်းဖို့ အတွက် လက်ခံကောင်မှာရှိတဲ့ DNA အချို့ကို ဖယ်ရှား/ဖြတ်တောက် ပစ်ဖို့ အတွက် လိုအပ်တယ်။ အဲ့ဒီ အတွက်ကြောင့် Vector DNA ပေါ်မှာ ရှိတဲ့ restriction enzymes တွေကို အသုံးပြုပီးတော့မှ ဖြတ်တောက်ရမှာ ဖြစ်တယ်။ မျက်လုံးထဲ မြင်သာစေရန်အတွက် Vector DNA နဲ့ restriction enzymes အချို့ကို reference ပုံနဲ့ ဖော်ပြပေးလိုက်ရပါတယ်။ (The cloning vector pRB322. Image by Ayacop and Yikrazuul)
ဒီနေရာမှာ Vector ကနေမှ ဖြတ်တောက်လိုက်တဲ့ DNA ပမာဏ bp (basepairs) က ထည့်သွင်းလိုတဲ့ insert ရဲ့ DNA ပမာဏ (bp) နဲ့ တူညီစရာ မလိုဘဲနဲ့ အသုံးပြုတဲ့ Restriction enzyme sites ကသာ တူညီရမှဖြစ်ပါတယ်။ ဥပမာ Vector ကို EcoRI နဲ့ BamHI ရဲ့ enzyme sites နှစ်ခုကို အသုံးပြုပီး ဖြတ်တောက်လိုက်မယ်ဆိုရင် insert DNA ကိုလဲ EcoRI နဲ့ BamHIရဲ့ enzyme sites နှစ်ခုကို အသုံးပြုပီးတော့မှ ဖြတ်တောက်ပေးရမှာ ဖြစ်တယ်။ အဲ့တာမှသာ တူညီတဲ့ enzyme sites နှစ်ခုက Ligation လုပ်ခြင်းဖြင့် အချင်းချင်း တွေ့ဆုံပီးတော့မှ Recombinant DNA တစ်ခုအဖြစ်နဲ့ ဖြစ်ပေါ်လာမှာပဲ ဖြစ်ပါတယ်။
Restriction enzymes ကို ကြည့်မယ်ဆိုရင်လဲ နှစ်မျိုးနှစ်စားရှိပီးတော့မှ အဲ့တာတွေကတော့ Blunt ends (တုံးတိ) ဖြတ်တောက်ခြင်းနဲ့ (overhang/ sticky ends) (ချိတ်) လိုမျိုး ဖြတ်တောက်ခြင်းနှစ်ခုရှိပါတယ်။
enzyme cutting/digestion လုပ်တဲ့နေရာမှာလဲ သေချာပေါက် enzyme site နှစ်ခုကို သုံးရမှာမဟုတ်ဘဲနဲ့ enzyme site တစ်ခုထဲကိုပဲ ရွေးချယ်ပီး အသုံးပြုပီးတော့မှ digestion လုပ်လို့ ရပါတယ်။ ကိုယ်ပြုလုပ်လိုတဲ့ စမ်းသပ်ချက်နဲ့ ရည်ရွယ်ချက်ပေါ်မူတည်ပီးတော့မှ (single digest/ double digest) ကို ရွေးချယ် အသုံးပြုရမှာဖြစ်ပီးတော့ Restriction enzymes ရွေးချယ်ပုံနဲ့ ပတ်သတ်ပီးတော့မှ နောက်ပိုင်းမှ သက်သက် Blog တစ်ခု ရေးသားပီးတော့မှ ဖော်ပြပေးသွားမှာ ဖြစ်ပါတယ်။
မျက်စိထဲ ထင်သာမြင်သာအောင် one enzyme နဲ့ two enzymes အသုံးပြုပီး digestion လုပ်ခြင်းကို ပုံတစ်ခုကို reference ယူပီးတော့မှ ဖော်ပြပေးလိုက်ရပါတယ်။ (single vs double digest)
အဓိက ပြောပြချင်တဲ့ အကြောင်းအရာဖြစ်တဲ့ cloning မအောင်မြင်တဲ့ Vetor digestion ကို ပြောရမယ်ဆိုရင်..
Vetor digestion ပြည့်ပြည့်၀၀ မဖြစ်စေတဲ့ အကြောင်းအရာကို ပေးရမယ်ဆိုရင် အသုံးပြုတဲ့ enzymes ပမာဏ နည်းပါးခြင်း (Vector နဲ့ restriction enzymes) အချိုးမမျှတခြင်းနဲ့၊ incubation times တိုးတောင်းခြင်း၊ incubation temperature မမှန်ကန်ခြင်းနဲ့ Vector (e.g. bacteria plasmid) က DNA contamination ဖြစ်ခြင်း စတဲ့ အကြောင်းအရာများပဲ ဖြစ်တယ်။
ပုံမှန် 1 unit ရဲ့ Restriction enzyme ဟာ ဆိုရင် 1 ug substrate DNA (Vector) digestion reaction တစ်ခုစာ (Total 50 ul) မိနစ် ၆၀ စာ အတွက် အသုံးပြု လို့ရပါတယ်။
(Ref: 1 unit of restriction enzyme will completely digest 1 μg of substrate DNA in a 50 μl reaction in 60 minutes)
Restriction enzyme တစ်ခုက ဘယ်လောက် units ရှိလဲ ပါဝင်သလဲဆိုရင် (eg. 20,000 units/ml) ဆိုရင် 1 ul ထည့်ပီး အသုံးပြုမယ်ဆိုရင် 20 units အသုံးပြုတာ ဖြစ်ပါတယ်။
digestion က complete ဖြစ်လားမဖြစ်လားဆိုတာကိုတော့ Digestion လုပ်ထားတဲ့ DNA ကို electrophoresis လုပ်ပီးတော့မှ ဆုံးဖြတ်လို့ ရပါတယ်။
ယခု ဥပမာအနေနဲ့ enzyme digestion လုပ်ပြထားတဲ့ Vector ကတော့ pGRNA plasmid ပါ။ ဒီ plasmid ကတော့
No comments:
Post a Comment